細胞膜紅色熒光染色試劑盒（DiI）
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貨號
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產品名稱
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規格
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CD2040
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細胞膜紅色熒光染色試劑盒（DiI）
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200-1000次
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● 產品介紹：
細胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)，Cell
Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一種以DiI為熒光探針，能夠快速靈敏地對細胞膜進行紅色熒光染色標記的試劑盒。
DiI在進入細胞膜之前熒光非常弱，僅當進入到細胞膜后才可以被激發出很強的熒光。DiI被激發后可以發出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結合后的激發光譜和發射光譜參考上圖。其中，最大激發波長為549nm，最大發射波長為565nm。
本試劑盒如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5 ml時，可以進行200次檢測；96孔板每孔檢測體系的體積為100 μl時可以進行1000次檢測。
● 產品組成：
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組份貨號
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產品名稱
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規格
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貯存
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CD2040-01
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DiI（400×）
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0.25
ml
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-20℃
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CD2040-02
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染色緩沖液
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100
ml
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4℃
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-
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說明書
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1份
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● 貯存：
DiI（400×） -20℃避光保存，一年有效。染色緩沖液可以4℃貯存。
● 使用說明：
1. 細胞膜染色工作液制備：
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細胞膜染色工作液配制量
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1 ml
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10 ml
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DiI（400×）
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2.5 μl
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25 μl
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染色緩沖液
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997.5 μl
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9.975 ml
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細胞膜染色工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔的細胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個樣品的細胞膜染色工作液為0.5ml；對于切片，可以根據切片大小，每個切片使用100-200μl的細胞膜染色工作液。
注：不同細胞的最佳染色濃度略有不同，細胞膜染色工作液的最終濃度建議根據不同細胞系和實驗體系進行優化，可在1:100-1:400之間進行調整。
2. 懸浮活細胞染色：
2.1
加入適當體積的細胞膜染色工作液重懸細胞，使其密度為1×106/ml左右。
2.2
37℃避光孵育細胞5-20
min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以5
min作為初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
2.3
500×g常溫離心5
min。
2.4
吸除上清液，緩慢加入37℃預熱的細胞培養液重懸細胞。
2.5
用細胞培養重復漂洗沉淀一次。
2.6
流式細胞儀檢測，或將細胞封片觀察，封片時請避免使用含有甘油或其它有機物的封片劑，否則會影響染色并增加熒光背景，可以直接用PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。
3. 貼壁活細胞染色：
3.1
將貼壁細胞種于細胞培養皿、多孔細胞培養板或者細胞爬片上。
3.2
吸除細胞培養液，用PBS洗滌細胞2次。
3.3
加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。
3.4
37℃避光孵育細胞5-20
min，不同的細胞最佳培養時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
3.5
吸除細胞膜染色工作液，用PBS洗滌2次，然后加入37℃預熱的細胞培養液即可在熒光顯微鏡下觀察。
4. 固定后細胞或切片的染色：
注：DiI不建議用于固定后細胞或組織的染色，因為細胞固定后影響了細胞膜的結構，不能準確反映熒光標記位置。以下步驟僅供參考：
4.1.
使用4%多聚甲醛固定液進行固定。
4.2
吸除固定液，用PBS洗滌細胞3遍。
4.3
使用配制在PBS中的0.1%
Triton X-100進行通透，常溫10 min。然后用PBS洗滌細胞3遍。
4.4按照免疫染色的方法進行抗體的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。
4.5加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞或樣品。
4.6
37℃避光孵育5-20
min，最佳染色時間需要根據自己的實驗條件摸索，以達到最佳的熒光染色效果。
4.7吸除細胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。
● 實驗示例：
操作程序：293細胞調整密度1×105/ml，接種到6孔板中，培養30小時；去除培養基，PBS漂洗一次；33342染色37度10分鐘，去除33342染色液，加1.5
ml PBS，觀察拍照（40×）（圖A）；去除PBS，DiI染色，37度10分鐘，去除DiI染色液，加1.5ml PBS，觀察拍照（40×）（圖B）